全長轉(zhuǎn)錄組是指借助三代測序平臺對完整轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行不打斷的全長測序，序列準(zhǔn)確性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于需要進(jìn)行打斷測序的二代常規(guī)轉(zhuǎn)錄組，因此適用于進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)性的分析，例如可變剪切分析，可變剪切是指同一個(gè)基因的前體mRNA可以通過不同的剪接方式產(chǎn)生多種成熟的mRNA，進(jìn)而翻譯成不同的蛋白質(zhì)，是真核生物中及其重要的調(diào)控方式。

本次為各位老師帶來重慶醫(yī)科大學(xué)黃愛龍教授/唐開福教授團(tuán)隊(duì)在nature子刊?Nature Communications?中發(fā)表的題目為“SARS-CoV-2 N protein-induced Dicer, XPO5, SRSF3, and hnRNPA3 downregulation causes pneumonia”的文章。該文章研究了 SARS-CoV-2 N 蛋白如何影響 RNA 干擾 (RNAi) 和 RNA 剪接途徑，并揭示了這些途徑在 COVID-19 發(fā)病機(jī)制中的作用，有助于開發(fā)更有效的 SARS-CoV-2 相關(guān)肺炎治療方法。

中文題目：SARS-CoV-2 N蛋白誘導(dǎo)的Dicer、XPO5、SRSF3和hnRNPA3下調(diào)導(dǎo)致肺炎

英文題目：SARS-CoV-2 N protein-induced Dicer, XPO5, SRSF3, and hnRNPA3 downregulation causes pneumonia

發(fā)表期刊：Nature Communications?

影響因子：14.7

合作單位：重慶醫(yī)科大學(xué)

百邁客生物為該研究提供了小RNA測序和ONT全長轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)。

研究背景

2019 冠狀病毒病 （COVID-19） 由嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒 2 （SARS-CoV-2） 引起，具有高度異質(zhì)性，且發(fā)病病例分布在各個(gè)年齡群體中，但重癥及死亡率明顯字老年群體比較集中。DNA 損傷是導(dǎo)致衰老的關(guān)鍵因素，也是 COVID-19 發(fā)病機(jī)制的驅(qū)動因素，蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)喪失是衰老的另一個(gè)標(biāo)志，會導(dǎo)致不受抑制的炎性小體激活、功能失調(diào)的細(xì)胞器積累和細(xì)胞損傷，可能導(dǎo)致 COVID-19 的發(fā)病機(jī)制。Dicer 是 RNA 干擾 （RNAi） 通路的關(guān)鍵組成部分，在衰老過程中下調(diào)， RNAi 組分的敲除會導(dǎo)致 DNA 損傷，并且可能由于 miRNA的整體下調(diào)而增加蛋白質(zhì)合成，從而影響蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，與年齡相關(guān)的剪接因子失調(diào)發(fā)生在不同生物體的多個(gè)組織中，并且與基因組穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)有關(guān)，可通過R環(huán)誘導(dǎo) DNA 損傷。然而，RNAi 成分及RNA 剪接因子在 COVID-19 發(fā)病機(jī)制中的確切作用還有待明確。

材料和方法

材料：異位表達(dá) N 蛋白的人肺癌 （A549） 和人正常肺上皮 （BEAS-2B） 細(xì)胞系 ，N 蛋白誘導(dǎo)的雄性肺損傷小鼠及正常對照 C57BL/6J 雄性小鼠；

方法：小RNA測序+ONT全長轉(zhuǎn)錄組+免疫組化+RIP等

研究結(jié)果

1.SARS-CoV-2核衣殼 （N） 蛋白誘導(dǎo)自噬降解及DNA損傷的作用機(jī)制

通過對已發(fā)表的COVID-19 患者RNA測序數(shù)據(jù)的分析，確定了重癥 COVID-19 患者 M-MDSC 中 RNAi 成分和剪接因子的 mRNA 水平低于無癥狀 COVID-19 患者，且已故 COVID-19 患者肺組織中的 RNAi 成分和剪接因子水平也低于未感染 COVID-19 的個(gè)體，表明RNAi 成分和剪接因子的表達(dá)減少與 COVID-19 感染加重有關(guān)。

細(xì)胞沉默逆轉(zhuǎn)測定使用含有內(nèi)含子的熒光素酶報(bào)告基因小基因證明了 SARS-CoV-2 抑制了該小基因的剪接。該研究從相互作用數(shù)據(jù)集的生物通用存儲庫 （BioGRID） 中檢索了 N 蛋白的推定蛋白質(zhì)相互作用子，并用免疫共沉淀測定證實(shí)了異位表達(dá) N 蛋白的人肺癌 （A549） 和人正常肺上皮 （BEAS-2B） 細(xì)胞系中 N 蛋白與?Dicer、XPO5、SRSF3和hnRNPA3?之間的相互作用，進(jìn)一步定量測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2 感染導(dǎo)致?Dicer、XPO5、SRSF3和hnRNPA3在蛋白水平上下調(diào)，但在 mRNA 水平上不下調(diào)，而自噬抑制劑氯喹或巴弗洛霉素 A1 治療可緩解 N 蛋白或 SARS-CoV-2 誘導(dǎo)的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?下調(diào)，用蛋白酶體抑制劑 MG132 處理并無效果，表明?N 蛋白對?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?蛋白表達(dá)的影響是自噬依賴性的。

在 BioGRID 數(shù)據(jù)庫中找到了一種自噬受體蛋白SQSTM1/p62 ，共聚焦顯微鏡分析和免疫共沉淀分析分別證實(shí)了 N 蛋白和 p62 之間的相互作用及其共定位，p62 敲低部分緩解了 N 蛋白誘導(dǎo)的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?蛋白的下調(diào)；然而，它不會影響不表達(dá) N 蛋白的細(xì)胞中的?Dicer、XPO5、SRSF3?或?hnRNPA3?蛋白水平，表明?p62 通過與 N 蛋白的相互作用將 N 蛋白相互作用蛋白（包括?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3）募集到吞噬細(xì)胞中，導(dǎo)致自噬降解。

ATM等的磷酸化、DNA 斷裂積累等病灶形成證明了異位 N 蛋白表達(dá)或 SARS-CoV-2 感染誘導(dǎo)了 DNA 損傷，敲低?Dicer、XPO5、SRSF3?或?hnRNPA3?導(dǎo)致 DNA 損傷，而它們的過表達(dá)部分減輕了 N 蛋白誘導(dǎo)的 DNA 損傷，同時(shí)異位 N 蛋白表達(dá)或 SARS-CoV-2 感染誘導(dǎo)了 R 環(huán)積累，進(jìn)一步誘導(dǎo)DNA損傷，RNase H1（一種降解 R 環(huán)的 RNA 部分的核糖核酸內(nèi)切酶）的過表達(dá)部分減輕了這種影響并減少了 DNA 損傷積累，總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明?N 蛋白誘導(dǎo)的 Dicer 、 XPO5 、 SRSF3 和 hnRNPA3 表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致 DNA 損傷。

2.SARS-CoV-2 N蛋白通過抑制 miRNA 生物發(fā)生及抑制 RNA 剪接作用機(jī)制

XPO5和Dicer在 miRNA 生物合成中起關(guān)鍵作用，小 RNA 深度測序顯示，N 蛋白誘導(dǎo) miRNA 表達(dá)的整體下調(diào)，對 A549 和 BEAS-2B 細(xì)胞中表達(dá)量最高的前五個(gè) miRNA進(jìn)行定量驗(yàn)證顯示，它們在表達(dá) N 蛋白的細(xì)胞和 SARS-CoV-2 感染的細(xì)胞中均下調(diào)；生化分級分離實(shí)驗(yàn)顯示，異位 N 蛋白表達(dá)或 SARS-CoV-2 感染誘導(dǎo) pre-miRNA 的核保留，如細(xì)胞核中 pre-miRNA 水平的增加和細(xì)胞質(zhì)中 pre-miRNA 水平的降低所示，?XPO5過表達(dá)后得到緩解。此外，異位 N 蛋白表達(dá)或 SARS-CoV-2 感染降低了成熟 miRNA 和 pre-miRNA 之間的比率，Dicer過表達(dá)后得到緩解?？傮w而言，這些發(fā)現(xiàn)表明，N 蛋白通過降低?XPO5?表達(dá)阻斷 pre-miRNA 從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的運(yùn)輸，并通過下調(diào)?Dicer?表達(dá)抑制 pre-miRNA 向成熟 miRNA 的加工。

SRSF3或hnRNPA3敲除抑制了含有內(nèi)含子的報(bào)告基因小基因的剪接，證實(shí)了它們確實(shí)是剪接因子，而它們的過表達(dá)部分緩解了 N 蛋白或 SARS-CoV-2 感染對 RNA 剪接的抑制作用，進(jìn)一步進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測序，通過可變剪接分析發(fā)現(xiàn)，N 蛋白誘導(dǎo)內(nèi)含子保留。此外，RT-qPCR證實(shí)，異位 N 蛋白表達(dá)或 SARS-CoV-2 感染降低了一組內(nèi)源性內(nèi)含子的剪接效率，SRSF3?和?hnRNPA3?過表達(dá)部分減輕了 N 蛋白和 SARS-CoV-2 對 RNA 剪接的抑制作用，這些結(jié)果表明，N 蛋白通過降低?SRSF3?和?hnRNPA3?的表達(dá)來抑制 RNA 剪接。

剪接抑制會誘導(dǎo)廣泛的 IR 和隨后的內(nèi)含子保留 mRNA 的翻譯，一部分內(nèi)含子衍生的多肽容易縮合且具有蛋白毒性，用嘌呤霉素對新生多肽進(jìn)行代謝標(biāo)記，結(jié)果顯示異位 N 蛋白表達(dá)或 SARS-CoV-2 感染誘導(dǎo)不溶性蛋白合成增加，而N蛋白與RNA的結(jié)合主要在可溶性蛋白部分被檢測到，免疫熒光檢測結(jié)果表明，N 蛋白和 SARS-CoV-2 感染誘導(dǎo)了 EGFP 聚集體的產(chǎn)生，誘導(dǎo)蛋白毒性應(yīng)激。

3.SARS-CoV-2 N 蛋白在蛋白水平的影響及動物模型驗(yàn)證

盡管異位 N 蛋白表達(dá)或 SARS-CoV-2 感染導(dǎo)致 4EBP1 去磷酸化，但它增加了整體蛋白質(zhì)合成，而沒有顯著影響 S6K1 磷酸化，對照組的刺突蛋白和膜蛋白對整體蛋白質(zhì)合成沒有影響，而包膜蛋白甚至抑制了整體蛋白質(zhì)合成，Dicer?或?XPO5?敲低導(dǎo)致 JNK 激活和 4EBP1 去磷酸化，同時(shí)略微增加 S6K1 磷酸化并促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，表明 N 蛋白通過降低?Dicer?和?XPO5?表達(dá)來促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，并通過下調(diào)?SRSF3?和?hnRNPA3?表達(dá)來抑制蛋白質(zhì)合成。由于?Dicer?和?XPO5?的下調(diào)比?SRSF3?和?hnRNPA3?的下調(diào)更顯著地促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，因此 N 蛋白最終增強(qiáng)了蛋白質(zhì)合成。

小鼠體內(nèi)驗(yàn)證結(jié)果顯示， N 蛋白在小鼠肺組織中的表達(dá)導(dǎo)致?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?下調(diào)、DNA 損傷、胞質(zhì) DNA 積累、細(xì)胞凋亡、IFNβ、IL-6 和 NKG2D 配體上調(diào)，以及伴有明顯巨噬細(xì)胞浸潤的肺炎，肺組織中?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?敲低導(dǎo)致肺損傷和肺炎，而它們的過表達(dá)部分緩解了 N 蛋白誘導(dǎo)的肺炎，這些結(jié)果表明，N 蛋白誘導(dǎo)的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?蛋白表達(dá)下調(diào)是 SARS-CoV-2 誘導(dǎo)肺炎的一種機(jī)制。

分析已發(fā)表的 3、6、12 和 24 個(gè)月齡 C57BL/6J 小鼠肺組織的 RNA 測序數(shù)據(jù)，在 8 周齡和 18 個(gè)月齡 C57BL/6J 小鼠的 mRNA 和蛋白質(zhì)水平上證實(shí)了肺組織中?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的年齡依賴性下調(diào)， DNA 損傷、細(xì)胞凋亡等功能在老年小鼠中明顯富集，結(jié)合Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?敲低實(shí)驗(yàn)，表明，Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的年齡相關(guān)下調(diào)與 N 蛋白誘導(dǎo)的肺炎嚴(yán)重程度增加有關(guān)。

PJ34 是一種（ADP-核糖）聚合酶 （PARP） 抑制劑，免疫沉淀結(jié)果表明 PJ34 通過阻止 N 蛋白誘導(dǎo)的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的下調(diào)來緩解肺炎，阿那曲唑是一種增強(qiáng) Dicer 表達(dá)的芳香化酶抑制劑，WB結(jié)果表明，阿那曲唑通過促進(jìn)?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的表達(dá)來緩解 SARS-CoV-2 N 蛋白誘導(dǎo)的肺炎。

思路發(fā)散

本研究通過數(shù)據(jù)庫檢索及分子實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證先初步推測SARS-CoV-2 N蛋白的年齡依賴調(diào)控機(jī)制與RNAi以及可變剪接相關(guān)，之后通過組學(xué)測序在整體水平上驗(yàn)證了猜測并進(jìn)一步細(xì)化了調(diào)控方式，之后再通過大量過表達(dá)及敲降后對應(yīng)分子在RNA及蛋白水平的定量驗(yàn)證了結(jié)果，是一個(gè)比較經(jīng)典有效的實(shí)驗(yàn)思路，可以在其他實(shí)驗(yàn)中參考。

參考文獻(xiàn)：

Luo YW, Zhou JP, Ji H, Xu D, Zheng A, Wang X, Dai Z, Luo Z, Cao F, Wang XY,Bai Y, Chen D, Chen Y, Wang Q, Yang Y, Zhang X, Chiu S, Peng X, Huang AL, Tang KF. SARS-CoV-2 N protein-induced Dicer, XPO5, SRSF3, and hnRNPA3 downregulation causes pneumonia.?Nat Commun. 2024 Aug 13;15(1):6964. doi:10.1038/s41467-024-51192-1.