該研究證明了部分腸道菌群與IgAN的之間的機(jī)制關(guān)系，為開發(fā)針對微生物群的食物干預(yù)措施改善IgAN提供科學(xué)依據(jù)。百邁客生物為該研究提供了全長16S?rRNA測序服務(wù)。
研究背景
IgA腎?。↖gAN）是全球最常見的免疫介導(dǎo)的原發(fā)性腎小球疾病，每年每10萬成年人中至少有2.5例發(fā)病。具有顯著的終身進(jìn)展至終末期腎病（ESRD）的風(fēng)險，約20%-40%的IgAN患者會在10至20年內(nèi)進(jìn)展至終末期腎病。因此迫切需要發(fā)現(xiàn)有效的治療靶點(diǎn)和新的干預(yù)策略。
一般來說，人類腸道中居住著數(shù)以萬億的細(xì)菌，這些細(xì)菌以膳食營養(yǎng)為燃料，可合成多種生物活性化合物。這些微生物代謝物進(jìn)一步向體內(nèi)遠(yuǎn)處的器官發(fā)出信號，使它們能夠與激素和免疫系統(tǒng)以及宿主的新陳代謝及其他功能相連接，腸道與宿主免疫系統(tǒng)之間復(fù)雜的相互作用影響著身體功能，這些功能將其與其他器官聯(lián)系起來，并導(dǎo)致它們之間形成“軸”。
慢性腎臟病通常是進(jìn)行性且不可逆的，腸道微生物群作為環(huán)境與人類之間的橋梁，在慢性腎臟疾病的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮著根本性作用。IgA?腎?。↖gAN）與腸道微生物群的平衡息息相關(guān)。然而，目前還不清楚腸道微生物群的變化是否會減弱IgAN或影響其進(jìn)展。
研究結(jié)果
? IgAN引起腎損傷和腎功能下降
根據(jù)以上研究背景，作者首先確認(rèn)了IgAN小鼠模型的成功建立。通過分析小鼠腎臟IgA免疫熒光染色，與對照組相比，IgAN組腎小球IgA（p?<?0.001）、C3（p?<?0.01）和IgG（p?<?0.001）沉積顯著增加。PAS染色顯示，IgAN組腎小球系膜細(xì)胞增生、系膜基質(zhì)增多及基底膜增厚。腎功能指標(biāo)評估顯示，與對照組相比，IgAN組小鼠血尿素氮（BUN）（p?<?0.001）、尿酸（UA）（p?<?0.01）、血清肌酐（Scr）（p?<??0.01）、血白蛋白（BAL）（p?<?0.05）及尿蛋白/肌酐比值（ACR）（p?<??0.001）水平顯著增加，IgAN組腎功能顯著下降，這可能與腎臟結(jié)構(gòu)損傷有關(guān)。
? IgAN引起腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂和多樣性失衡
通過構(gòu)建IgAN動物模型，作者發(fā)現(xiàn)與對照組相比，IgAN組的α多樣性分析均顯著降低。此外，采用非加權(quán)組平均法聚類（UPGMA樹）分析、非度量多維尺度分析（NMDS）和主坐標(biāo)分析（PCoA）進(jìn)行相似性聚類分析。結(jié)果顯示，IgAN組與對照組表現(xiàn)出明顯的微生物聚類，兩組間存在清晰的分組，表明IgAN誘導(dǎo)了微生物群落的轉(zhuǎn)變。
為識別IgAN腸道微生物群的有效特征，作者進(jìn)行了LEfSe（線性判別分析效應(yīng)大小)。發(fā)現(xiàn)在屬水平上，IgAN組中另枝菌屬（Alistipes）、鏈球菌屬（Streptococcus）、文肯菌屬（Rikenella）、埃希氏菌屬（Escherichia?Shigella）和乳酸桿菌（Lactobacillus）的豐度顯著增加。
相對應(yīng)的種水平豐度也發(fā)生了顯著的升高或降低，以上結(jié)果表明，IgAN誘導(dǎo)了腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂和多樣性失衡。
? IgAN引起腸道屏障損傷和腸道B細(xì)胞免疫失衡
隨后作者采用蘇木精-伊紅（H&E）染色法評估了各組治療小鼠的結(jié)腸完整性，以確定IgAN引起的腸道通透性變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對照組小鼠的黏膜上皮完整，固有層內(nèi)腺體豐富且排列致密有序，肌層結(jié)構(gòu)清晰。與此同時，IgAN模型小鼠的腸道腺體結(jié)構(gòu)疏松，局部出現(xiàn)松散，肌層增厚，并伴有輕微的淋巴細(xì)胞浸潤。此外，通過對腸道通透性指標(biāo)的評估發(fā)現(xiàn)，IgAN組小鼠血清中的二胺氧化酶（DAO）（p?<?0.001）、D-乳酸（D-LA）（p?<??0.01）和脂多糖（LPS）（p?<?0.01）水平顯著升高，尤其是在DAO水平上，這表明IgAN模型小鼠的腸道通透性增加。
通過評估B細(xì)胞活化因子和IgA水平，企圖闡明了IgAN的免疫失衡機(jī)制。結(jié)果顯示，與對照組相比，IgAN組小鼠的B細(xì)胞活化因子（BAFF）（p?<??0.001）和增殖誘導(dǎo)配體（APRIL）（p??<??0.001）水平顯著升高。IgA水平也異常升高（p?<?0.01），這表明B細(xì)胞過度活化導(dǎo)致IgA穩(wěn)態(tài)失衡。
總結(jié)來說，IgAN模型小鼠的腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致其腸道屏障完整性降低和B細(xì)胞IgA分泌失衡。
? COS可重塑IgAN小鼠模型的菌群失調(diào)
隨后，作者為探索調(diào)節(jié)IgAN的特定微生物群是否能改善疾病進(jìn)展，應(yīng)用了COS對IgAN中失調(diào)的微生物群進(jìn)行靶向調(diào)節(jié)。α多樣性比較結(jié)果顯示，經(jīng)不同劑量COS干預(yù)后，IgAN小鼠模型的腸道微生物群整體得到恢復(fù)。β多樣性分析（PCoA和PLS-DA）表明，與對照組相比，COS干預(yù)后的腸道微生物群表現(xiàn)出顯著改變，其結(jié)構(gòu)向?qū)φ战M方向轉(zhuǎn)變。
腸道微生物群組成分析顯示，不同劑量COS干預(yù)后富集的微生物群存在差異：COS-L組主要富集未分類的毛螺菌科（unclassified?Lachnospiraceae）、支原體屬（Anaeroplasma）、振蕩桿菌屬（Oscillibacter）、嗜木糖真桿菌群（Eubacterium?xylanophilum?group）和單球?qū)伲∕onoglobus）；而COS-H組主要富集未培養(yǎng)的擬桿菌目細(xì)菌（uncultured?Bacteroidales?bacterium）、理研菌屬（Rikenella）、臭味桿菌屬（Odoribacter）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）。
與此同時發(fā)現(xiàn)：COS-L（低劑量殼寡糖）和COS-H（高劑量殼寡糖）均有效抑制了IgAN模型中顯著增加的微生物豐度，由此，實(shí)現(xiàn)了對IgAN模型腸道微生物群的反向平衡調(diào)節(jié)。
? 靶向微生物調(diào)控減輕腸道屏障損傷，并且對IgA發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用
此外，作者進(jìn)一步探討了調(diào)節(jié)特定微生物群落對腸道屏障和黏膜免疫的影響。結(jié)果顯示，COS干預(yù)組顯著改善了腸道通透性指標(biāo)。對D-LA和LPS的改善效果呈劑量依賴性，其中COS-H組的改善效果最佳。陽性對照組也顯示出對IgAN模型引起的腸道損傷的改善。H&E染色還顯示，COS干預(yù)導(dǎo)致結(jié)腸結(jié)構(gòu)清晰完整，腸腺排列規(guī)則，趨于正?；?/p>
同時，COS干預(yù)緩解了IgAN模型中B細(xì)胞過度活化引起的IgA失衡。顯著降低了小鼠血清中BAFF（COS-L組，p?<??0.001；COS-H組，p?<?0.001）和APRIL（COS-L組，p?<?0.001；COS-H組，p?<?0.001）的水平。COS-H組的IgA水平顯著降低（p?<?0.05）?？偨Y(jié)來說，針對IgAN中特定微生物群落的靶向調(diào)節(jié)可抑制APRIL和BAFF的過表達(dá)，從而對IgA發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。
? IgAN患者糞菌移植會引起模型小鼠產(chǎn)生腎損傷
采用人類微生物群相關(guān)HMA-IgAN小鼠模型探討小鼠模型與人類微生物群的差異，并計(jì)劃驗(yàn)證IgAN誘導(dǎo)的人體腸道微生物群演變對小鼠腎功能的影響。腎免疫熒光顯示，HMA-IgAN小鼠腎小球IgA（p?<?0.01）、C3（p?<?0.01）和IgG（p?<?0.001）沉積與IgAN模型小鼠觀察到的結(jié)果相似。PAS染色顯示，HMA-IgAN小鼠腎小球系膜細(xì)胞顯著增生伴炎性浸潤，與IgAN模型組相似。與HMA-HC組相比，HMA-IgAN小鼠表現(xiàn)出與IgAN模型相似的腎損傷，血尿素氮（BUN，p?<?0.05）、尿酸（UA，p?<??0.05）、血肌酐（Scr，p?<?0.001）和尿白蛋白/肌酐比（ACR，p?<?0.01）顯著升高。
這些結(jié)果表明，IgAN狀態(tài)下的腸道微生物群可誘導(dǎo)成功構(gòu)建IgAN小鼠模型，并導(dǎo)致宿主腎損傷，其損傷程度與IgAN小鼠模型觀察到的損傷相當(dāng)。
? HMA-IgAN小鼠模型重現(xiàn)了腸道菌群失調(diào)
進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)：與HMA-HC組相比，HMA-IgAN組小鼠腸道微生物群的α多樣性顯著降低。β多樣性分析顯示，兩組的聚類之間存在明顯的分化。兩組的微生物群特征也存在顯著差異。在屬水平上，HMA-IgAN小鼠表現(xiàn)出擬桿菌屬（Bacteroides）、未培養(yǎng)的擬桿菌目細(xì)菌（uncultured?Bacteroidales?bacterium）、丹毒絲菌屬（Erysipelatoclostridium）和厭氧梭菌屬（Anaerofustis）的增加。相對應(yīng)的種水平豐度也發(fā)生了顯著的升高或降低，以上結(jié)果表明，HMA-IgAN小鼠模型可以誘導(dǎo)腸道微生物群多樣性（ACE、Shannon和Chao1指數(shù)）的紊亂以及微生物群落結(jié)構(gòu)的改變。
? COSF增加了HMA-IgAN小鼠模型腸道菌群多樣性，并且維持了腸道穩(wěn)態(tài)
最后，作者在IgA腎?。↖gAN）小鼠模型中，進(jìn)一步給予COS和COSF（殼寡糖制劑）進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果顯示，COS和COSF干預(yù)皆顯著增加了HMA-IgAN小鼠腸道微生物群的α多樣性指數(shù)，從而增加了腸道微生物群的豐富度。聚類結(jié)果顯示，HMA-IgAN組的樣本與對照組和干預(yù)組的樣本明顯分離，干預(yù)組樣本傾向于與對照組相似。采用LEfSe分析比較了HMA-HC組、HMA-IgAN組、COS干預(yù)組和COSF干預(yù)組之間的差異微生物群，并鑒定了各組的差異微生物群。在屬水平，COS可富集雙歧桿菌（Bifidobacterium）和羅斯氏菌（Roseburia）。COSF組富集的微生物群包括普氏菌（Alistipes）、未分類的振蕩螺菌科（Oscillospiraceae）、臭味桿菌（Odoribacter）、里肯氏菌（Rikenella）和未培養(yǎng)的瘤胃菌。
相對應(yīng)的種水平豐度也發(fā)生了顯著的升高或降低，結(jié)合前期介紹的IgAN模型組COS干預(yù)后的微生物變化，可得出結(jié)論：COS和COSF能夠平衡兩個模型中特定微生物群的失調(diào)。
? COSF可改善HMA-IgAN小鼠模型的腎功能修復(fù)
最后作者發(fā)現(xiàn)COS與COSF（殼寡糖制劑）皆顯著改善了HMA-IgAN小鼠模型的各項(xiàng)腎功能指標(biāo)，顯著降低了UA（p?<?0.05）、Scr（p?<?0.01）、BUN（p?<?0.05）和ACR（p?<?0.001）水平。
腎小球PAS染色結(jié)果顯示，COS和COSF干預(yù)顯著降低了IgA（COS,?p?<??0.001;?COSF,?p?<?0.001）、C3（COS,?p?<?0.05;?COSF,?p?<?0.01）和IgG（COS,?p?<?0.01;?COSF,?p?<?0.01）的沉積，并對系膜細(xì)胞增殖和基質(zhì)擴(kuò)張具有明顯的抑制作用，其中COSF組在腎小球系膜區(qū)增殖方面顯示出更顯著的改善。
總結(jié)來說，COSF干預(yù)可通過靶向調(diào)節(jié)HMA-IgAN小鼠模型內(nèi)的特定微生物群落來增強(qiáng)腎功能。
研究總結(jié)
該研究采用IgAN和人類微生物群相關(guān)模型來研究IgAN對腸道微生物群改變的影響以及腸道微生物群的可能會觸發(fā)?IgAN的機(jī)制。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)了殼聚糖?（COS）和COS制劑（COSF）具有微生物群靶向功能，可增強(qiáng)腸道屏障和腎功能的作用。這些結(jié)果表明，IgAN可導(dǎo)致α多樣性降低和腸道微生物群的結(jié)構(gòu)改變。同時，腸道也出現(xiàn)了B細(xì)胞免疫失衡和緊密連接蛋白水平降低（ZO-1和Occludin）。而COS/COSF可通過靶向調(diào)節(jié)富集腸道屏障和粘膜免疫相關(guān)微生物群來增強(qiáng)腸道ZO-1表達(dá)，減少B細(xì)胞活化因子（BAFF）和增殖誘導(dǎo)配體（APRIL）過表達(dá)，從而減少IgAN中的腎損傷。
總之，該研究證明了部分腸道菌群與IgAN的之間的機(jī)制關(guān)系，為開發(fā)針對微生物群的食物干預(yù)措施改善IgAN提供科學(xué)依據(jù)。
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