該文研究了SntI對基本細(xì)胞過程的影響，闡明了其與脂質(zhì)的分子相互作用，評估了其對衰老癌細(xì)胞的選擇性，并評估了增強(qiáng)生成的變異體在對抗癌癥和化療誘導(dǎo)的衰老方面的體內(nèi)療效。此外，該研究為一類天然衍生化合物能夠靶向衰老細(xì)胞這一概念提供了理論依據(jù)，這有可能開創(chuàng)一種全新的衰老細(xì)胞清除劑的類別。百邁客生物為該研究提供了轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)。

研究背景

細(xì)胞衰老是衰老的驅(qū)動因素，也是腫瘤進(jìn)展的屏障，但衰老細(xì)胞的持續(xù)積累會引發(fā)炎癥和腫瘤復(fù)發(fā)。化療雖能抑制腫瘤，卻會誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中出現(xiàn)衰老細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致治療相關(guān)不良反應(yīng)并可能支持腫瘤復(fù)發(fā)?，F(xiàn)有衰老溶解藥物（senolytics）存在治療窗口窄、脫靶毒性、效價低或生物利用度有限等問題，亟需開發(fā)更有效的衰老治療方法和化合物。

毒液和毒素是新型治療劑的寶貴來源，其具有極高的特異性和效價，部分毒液中的肽已被證實可抑制腫瘤細(xì)胞生長和擴(kuò)散。

研究結(jié)果

• 探究來自加勒比海?？疽旱某煽锥舅豐ticholysin?I（StnI）的衰老溶解特性。
• 闡明StnI與脂質(zhì)的分子相互作用及其對衰老癌細(xì)胞的選擇性機(jī)制。
• 評估StnI優(yōu)化變體（StnIG）在體內(nèi)針對癌癥和化療誘導(dǎo)衰老的療效。
• 提出?“senotoxins”（衰老毒素）這一新型天然來源化合物類別，為衰老相關(guān)疾病治療提供新思路。

? StnI的體外衰老溶解特性細(xì)胞衰老誘導(dǎo)與表型驗證

通過palbociclib抑制CDK4/6，或使用多柔比星、博來霉素處理，成功誘導(dǎo)人黑色素瘤SKMel-147細(xì)胞、肝癌Huh7細(xì)胞、肺腺癌A549細(xì)胞、神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)。衰老細(xì)胞表現(xiàn)為p53磷酸化水平降低、p21????表達(dá)升高、SA-β-半乳糖苷酶活性增強(qiáng)，且形態(tài)增大變扁平。

濃度與時間依賴性：StnI（0.1?nM-3?μM）對衰老SKMel-147細(xì)胞的viability具有濃度依賴性抑制作用，增殖細(xì)胞的IC??約為240nM，而palbociclib處理的衰老細(xì)胞IC??約為30?nM，衰老溶解指數(shù)為8。低濃度StnI（10-30?nM）的作用具有時間依賴性，延長暴露時間可增強(qiáng)衰老溶解效果。

效價優(yōu)勢：StnI的衰老溶解功效與navitoclax相當(dāng)，但效價是其13倍，且在多種化療誘導(dǎo)的衰老模型中均保持強(qiáng)效活性。同時，StnI處理不會改變衰老細(xì)胞的p16????、p21????表達(dá)及p53磷酸化水平，僅選擇性殺傷衰老細(xì)胞。

? StnI的結(jié)構(gòu)改造與優(yōu)化（StnIG的構(gòu)建）

結(jié)構(gòu)域功能驗證：對StnI的N端兩親α-螺旋（aa1-29）、β-折疊區(qū)（aa58-101）、芳香簇（112-116）等結(jié)構(gòu)域進(jìn)行截短改造，所有截短體均喪失衰老溶解活性，且對增殖細(xì)胞和衰老細(xì)胞的細(xì)胞毒性極低。蛋白質(zhì)變性（95℃處理45分鐘）后，StnI的衰老溶解活性完全消失，表明其全長序列和構(gòu)象對活性至關(guān)重要。

同源變體對比：StnI與同源變體StnII（序列同源性93%）相比，StnII對衰老細(xì)胞的細(xì)胞毒性低47倍（IC??≈1.4?μM?vs?30?nM），選擇性指數(shù)僅為0.92，遠(yuǎn)低于?S8。差異源于N端電荷特性，StnI?N端含酸性殘基（E2、D9、E16）帶負(fù)電，而?StnII?N端為中性氨基酸。

StnIG的構(gòu)建與優(yōu)勢：通過在N端引入甲硫氨酸（分泌時切除）、C端添加6xHis標(biāo)簽，構(gòu)建優(yōu)化變體StnIG。StnIG對增殖細(xì)胞的IC??約為1?μM，對衰老細(xì)胞的IC??仍為30nM，衰老溶解指數(shù)提升至31.25，高于StnI（8）和navitoclax（22.4）。StnIG處理24小時后，衰老細(xì)胞的損傷不可逆，而增殖細(xì)胞可逐漸恢復(fù)。

? StnI對細(xì)胞代謝與離子穩(wěn)態(tài)的影響

轉(zhuǎn)錄組變化：對palbociclib誘導(dǎo)的衰老細(xì)胞進(jìn)行StnI（100?nM）處理，RNA測序顯示，6-12小時后細(xì)胞代謝通路（戊糖磷酸途徑、氧化磷酸化、三羧酸循環(huán)等）顯著失調(diào)，腫瘤相關(guān)信號通路（TGF-β、JAK-STAT、MAPK等）下調(diào)。同時，鞘脂生物合成通路及離子轉(zhuǎn)運、鈣穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因（41個膜電位相關(guān)基因、40?個鈣信號相關(guān)基因）早期即出現(xiàn)表達(dá)異常。

線粒體功能損傷：StnI和StnIG處理后，衰老細(xì)胞的線粒體呼吸在15分鐘內(nèi)短暫升高，隨后持續(xù)下降（StnI組降低33.5%±7%，StnIG組降低31.1%±2%），而變性StnIG無此效果。增殖細(xì)胞經(jīng)StnIG處理后，基礎(chǔ)呼吸僅降低15.1%±2%，遠(yuǎn)低于衰老細(xì)胞。衰老細(xì)胞的線粒體膜電位去極化，ATP偶聯(lián)效率、最大呼吸能力和備用呼吸容量均顯著降低，且持續(xù)24小時以上，伴隨凋亡增加（Annexin?V陽性細(xì)胞比例升高）。

離子平衡紊亂：膜片鉗分析顯示，衰老細(xì)胞的細(xì)胞膜去極化，鉀通道（主要為鈣激活鉀通道KCa）密度降低。StnIG處理后，衰老細(xì)胞出現(xiàn)持續(xù)的鉀外流、鈉內(nèi)流和鈣內(nèi)流，細(xì)胞膜超極化。其中，鈣內(nèi)流主要來自細(xì)胞外，且可激活KCa通道（尤其是BKCa和IKCa亞型），進(jìn)一步促進(jìn)鉀外流，導(dǎo)致細(xì)胞體積減小。

? StnIG誘導(dǎo)衰老細(xì)胞死亡的機(jī)制

鈣依賴性細(xì)胞死亡：StnIG處理后，衰老細(xì)胞內(nèi)鈣水平持續(xù)升高，下調(diào)BKCa通道調(diào)節(jié)亞基KCNMB4，增強(qiáng)BKCa通道活性。使用鈣螯合劑（EGTA、BAPTA）或?BKCa通道阻滯劑（charybdotoxin）可顯著削弱StnIG的衰老溶解效果，表明鈣內(nèi)流和BKCa激活是細(xì)胞死亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

凋亡與焦亡的協(xié)同作用：StnIG誘導(dǎo)的衰老細(xì)胞死亡不依賴壞死性凋亡，但對caspase-1/4抑制劑（VX-765）和泛caspase抑制劑（z-VAD?FMK）敏感。流式細(xì)胞術(shù)證實，StnIG可誘導(dǎo)衰老細(xì)胞發(fā)生早期凋亡（不依賴BKCa激活），而持續(xù)的鈣內(nèi)流和BKCa激活促進(jìn)細(xì)胞體積減小和晚期凋亡，同時伴隨焦亡發(fā)生。BKCa激活劑BMS-191011可增強(qiáng)StnIG的細(xì)胞毒性。

? StnIG對衰老細(xì)胞的選擇性機(jī)制（脂質(zhì)結(jié)合特異性）

衰老細(xì)胞的脂質(zhì)組重塑：與增殖細(xì)胞相比，衰老SKMel-147細(xì)胞的脂質(zhì)譜發(fā)生顯著變化，磷脂酰絲氨酸（PS）、鞘磷脂（SM）和線粒體心磷脂（CL）含量降低，磷脂酰膽堿（PC）、醚鍵磷脂酰乙醇胺（PE?O-）、膽固醇酯（CE）和甘油三酯（TAG）含量升高。同時，溶血磷脂（LPC、LPE-O、LPI、LPS）含量增加。

脂質(zhì)對StnIG毒性的調(diào)控：補(bǔ)充PC（100?μM?POPC）可增強(qiáng)增殖細(xì)胞對StnIG的敏感性；外源性鞘磷脂酶降解SM后，StnIG的細(xì)胞毒性增強(qiáng)；補(bǔ)充SM（100?μM）可減輕StnIG對衰老細(xì)胞的損傷，但會增加其對增殖細(xì)胞的毒性；脂蛋白耗竭血清（LPDS）處理后，StnIG對增殖細(xì)胞的毒性增強(qiáng)，對衰老細(xì)胞的毒性減弱。

分子結(jié)合機(jī)制：基于同源蛋白FraC的晶體結(jié)構(gòu)建模顯示，StnIG的α2螺旋（膜結(jié)合區(qū)）含關(guān)鍵殘基Gln130、Tyr133、Glu134等，其中Glu134和Gln130可與?PE、PS脂質(zhì)的頭部基團(tuán)形成穩(wěn)定氫鍵（結(jié)合距離<3??），且結(jié)合持續(xù)時間顯著長于與其他脂質(zhì)的相互作用。健康細(xì)胞中PE、PS位于細(xì)胞膜內(nèi)葉，而衰老細(xì)胞的膜不對稱性破壞，PE、PS暴露于外葉，為StnIG提供特異性結(jié)合位點。

? StnI/StnIG的體內(nèi)療效驗證

斑馬魚異種移植模型：將palbociclib誘導(dǎo)的衰老SKMel-147細(xì)胞注射到斑馬魚胚胎的Cuvier循環(huán)導(dǎo)管，10?nM?StnIG處理6天后，衰老細(xì)胞積累量顯著降低，效果與1μM?navitoclax相當(dāng)，且無明顯毒性。

小鼠異種移植模型：在SKMel-147黑色素瘤和Huh7肝癌小鼠異種移植模型中，palbociclib（100?mg/kg，口服）聯(lián)合StnIG（2?mg/kg，腹腔注射，每48小時一次）治療，腫瘤體積顯著縮小，療效與palbociclib聯(lián)合navitoclax（50?mg/kg，口服）相當(dāng)。腫瘤組織中SA-β-半乳糖苷酶活性降低，SASP相關(guān)基因（IL-6、BCL2、CASP1）表達(dá)顯著下調(diào)。

安全性評估：StnIG處理的小鼠體重僅降低5%-10%（navitoclax組為?5%），對腦、心、肺、肝、腎等器官無明顯組織學(xué)損傷，肝腎功能指標(biāo)正常。僅在衰老腫瘤組中觀察到血鉀水平升高，可能與腫瘤細(xì)胞裂解釋放鉀離子相關(guān)，可作為治療效果的生物標(biāo)志物。

? StnIG在非轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的作用

對化療誘導(dǎo)的新生兒包皮成纖維細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞無衰老溶解效果，但對復(fù)制性衰老成纖維細(xì)胞具有顯著的衰老溶解活性。

在人肺成纖維細(xì)胞IMR90中，StnIG具有衰老形態(tài)調(diào)節(jié)作用（senomorphic?effect），10.13?nM即可顯著降低SA-β-半乳糖苷酶活性，且不誘導(dǎo)細(xì)胞死亡；134.6?nM時表現(xiàn)出衰老溶解活性，有效清除衰老細(xì)胞群體。

研究總結(jié)

該研究為StnIG在癌癥治療中的潛在作用提供了概念性證明，表明其與誘導(dǎo)腫瘤衰老的化療藥物聯(lián)合使用時療效顯著提升。還證實了StnIG在人類成纖維細(xì)胞中的衰老相關(guān)潛力，這引發(fā)了關(guān)于其在衰老及與衰老相關(guān)疾病中的作用的更多疑問。然而，關(guān)于senotoxins對未轉(zhuǎn)化和有復(fù)制能力的衰老細(xì)胞的衰老消除作用背后的機(jī)制仍不清楚。未來的研究還應(yīng)探究StnIG在其他與衰老相關(guān)的疾?。ㄈ绶卫w維化?、腎臟疾病或甚至改善早老癥綜合征的癥狀）中的療效。

 
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